西京结构文献谈｜用于心脏瓣膜组织工程的海藻酸钠水凝胶支架的制备
王义为 2023-05-11 20:03

2023年5月（总第6期）

作者：王义为，李兰兰，刘洋，杨剑

Highlight

本文亮点：

1）介绍由海藻酸钠水凝胶进行3D生物打印得到的心脏瓣膜支架；


2）将ECM蛋白和自体活细胞加入海藻酸钠水凝胶中进行3D生物打印可以有效地避免细胞脱落等相关问题发生；


3）在重现心脏生理流量和压力条件的生物反应器中对生物瓣膜支架进行测试，其结果验证了海藻酸钠水凝胶支架可以用于心脏瓣膜组织工程。

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组织工程心脏瓣膜(TEHV)有潜力提供具有生长、重塑和再生能力的瓣膜替代品。除了作为一种替代物外，还可以作为研究疾病和药物治疗的模型，以更好地了解主动脉瓣的生理和病理机制。为了应对与细胞脱落机制有关的各种问题，应用可吸收生物材料和3D打印技术制造出的TEHV最近被开发出来[1-7]。本文主要介绍了一种利用低成本且生物相容性较好的海藻酸钠水凝胶进行3D生物打印制作的主动脉瓣膜支架，并且避免了与脱细胞相关的免疫原性问题。


脱细胞异种移植和同类异种移植作为一种 “现成”的解决瓣膜衰败问题的方案，在短期内展现出了良好的效果，并已进入多项临床研究[5-9]。脱细胞异种移植物在植入后可以表现出重塑和生长潜力，观察到自体细胞再生。不幸的是，脱细胞异种移植仍然导致免疫反应的高风险，特别是在免疫系统反应性比老年人更好的年轻人中。潜在的异种疾病传播的风险也仍然存在。这些问题最终导致长期的瓣膜功能退化[10-13]，可能是由于不完全脱细胞。脱细胞同种移植物瓣膜与组织重塑[10,12,14]和长期良好的生理功能有关[15-19]。然而，与异种移植瓣膜相比，同种移植瓣膜的可用性有限。对于脱细胞同种移植瓣膜来说潜在残留免疫原性问题也仍然存在[2,5,7]。此外，脱细胞过程对同种和异种瓣膜的生物力学稳定性都有影响。
可吸收生物材料在制造心脏瓣膜支架方面拥有快速、经济、可再生的特性，并表现出快速细胞化、细胞外基质(ECM)沉积和植入后支架降解等优点[4-7]。此外，新的3D生物打印技术促进了个性化的复杂心脏瓣膜支架结构工程的发展，其中就包含利用ECM蛋白和自体活细胞进行3D生物打印[6-9]。在体外制作过程中，将自体细胞和ECM蛋白均匀地添加到水凝胶配方中并浇灌在3D打印的糖基化玻璃模具上，从而得到具有良好形态和高细胞存活率的生物瓣膜支架。这种生物制造方法用于体外培养方法的主动脉瓣工程，将细胞添加到水凝胶混合物中，可以优化细胞活力，促进细胞外基质的产生等。依照现有的实验结果进行预测，海藻酸钠水凝胶进行3D生物打印得到的心脏瓣膜支架的预期组织力学性能将随着时间的推移而发展，根据心脏生物反应器提供的逐渐增加的动态刺激，这将刺激细胞活性和细胞外基质的产生。在这些生理条件下，海藻酸盐会以受控的方式降解[10]，然后由细胞产生的细胞外基质取代。因此，本文所述的主动脉瓣水凝胶支架经过动态条件下延长细胞培养时间后，细胞填充的水凝胶支架将显示出与原生主动脉瓣相似的血流分布和耐久性。同样，本文所介绍的支架的力学性能评估对于验证制作方法和确认主动脉瓣模型形态足以再现原始主动脉瓣的生理功能也是至关重要的。

图1主动脉瓣支架制作示意图。(a)主动脉瓣糖基化玻璃模具装载CaCl2，用0.5 mm的定制打印机喷嘴打印，层高0.2 mm。(b)模具内部截面。(c) 模具A部位显示中窦部的剖面图。(d)用注射器装载海藻酸钠配方，海藻酸钠装载GDL和CaCO3进行内凝胶，完成主动脉瓣支架的成型过程。糖/藻酸盐界面发生外凝胶化。(e)将注入海藻酸钠溶液的模具转移到溶解模块中。(f) 糖基化玻璃模具溶解时，加入CaCl2的总(入口/出口)流量为90 mL/min。

图2水凝胶支架配方的注射工艺。(a)印在注射模上的模具侧面图。(b)模具俯视图。印刷后观察到小糖玻璃丝(红色圆圈)。(c)在培养箱(37°c, 100%相对湿度)短时间放置后，模具表面轻微溶解(表面光滑，用红色表示)。然后用70%的乙醇填充模具。(d)在乙醇溶液中溶解后，菌丝所剩无几(红色圆圈)。(e)用海藻酸钠水凝胶溶液填充模具。(f)与(e)相比，水凝胶支架凝胶后发生收缩。白色箭头:模具底部未见渗漏。

图3糖基化玻璃模具的溶解过程和支架的最后凝胶阶段。(a) t = 0 min，虚线上方为新的CaCl2溶液，底部为溶解的糖基(淡黄色液体)。(b) t = 2分钟时，新鲜CaCl2溶液的进口射流(绿色箭头)在糖基化玻璃模具上打洞(红色圆圈)。蓝色箭头和蓝色边框区域显示的是正在下沉的内部结构。(c) t = 4分钟时模具溶解程度。(d) t = 6分钟时模具溶解程度。(e) t = 10分钟时，在虚线所代表的位置用手术刀手工切割支架。(f) t = 15min，完成溶解和凝胶过程。


图4(a) 60次BPM时来自于主动脉和心室的平均测量流速和(b)压力归一化曲线(n = 12个心动周期)。这些数据是在三个主动脉瓣支架上使用定制的心脏生物反应器获得的(测量数据曲线)，并与生理值曲线[20]进行比较。竖轴表示三个主动脉瓣支架在每次采集时间(100hz)的平均廓线的标准差。

结论

这种生物制造方法用于体外培养方法的主动脉瓣工程，将细胞添加到水凝胶混合物中，优化细胞活力，细胞外基质的产生等。我们预测，预期的组织力学性能将随着时间的推移而发展，依赖于心脏生物反应器提供的逐渐增加的动态刺激，这将刺激细胞活性和细胞外基质的产生。在这些生理条件下，海藻酸盐会以受控的方式降解[7]，然后由细胞产生的细胞外基质取代。因此，本文所述的主动脉瓣水凝胶支架并不打算直接植入患者体内，而是在动态条件下延长细胞培养时间后，细胞填充的水凝胶支架将显示出与原生主动脉瓣相似的血流分布和耐久性。因此，本文所介绍的支架的力学性能评估对于验证制作方法和确认主动脉瓣模型形态足以再现原始主动脉瓣的生理功能是至关重要的。
本研究建立了一种制造具有天然形状的海藻酸钠主动脉瓣支架方法的可行性。该方法使用糖玻璃印刷模具快速铸造支架。这是一种相对简单和低成本的方法，可以帮助制造更多个性化的组织工程心脏瓣膜便于需要瓣膜置换术的患者使用。支架制造的可靠性和可重复性还需要进一步测试。接下来的工作将是优化水凝胶中的细胞配比，确保细胞最佳活性，并在心脏生物反应器中动态培养后将支架改造成组织工程心脏瓣膜。

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原文链接：

https://www.mdpi.com/1422-0067/23/15/8567，DOI:10.3390/ijms23158567

专家简介

杨剑

空军军医大学西京医院

西京医院心血管外科一病区主任，博士生导师。美国心脏协会专家会员（FAHA）， 美国心脏病学会专家会员(FACC)。获聘陕西省中青年科技创新领军人才，陕西省科技创新团队带头人，为陕西省杰出青年科学基金项目获得者，获评第四届“国之名医”。研究领域包括心血管3D打印、新器械研发、应用转化及临床研究等，主编《心血管3D打印技术》等5部专著，在Eur Heart J，JACC等发表SCI论文100余篇。承担国家重点研发计划、国家自然科学基金等10余项课题，经费1000余万元。荣获国家科技进步二等奖、中华医学科技一等奖等多项奖励，授权国家专利30余项。

刘洋

空军军医大学西京医院

心血管外科博士，副主任医师，副教授，硕士研究生导师。微创结构性心脏病组组长，ECMO组组长。

美国马里兰大学医学院博士后。国家心血管病专家委员会微创心血管外科专业委员会委员。专注心血管疾病微创治疗。先后开展微创介入瓣膜病修复及置换术，瓣膜置换术后瓣周漏介入封堵术，冠状动脉漏介入封堵术等多项心血管疾病微创治疗新技术。在国内外发表研究论著70余篇，其中SCI论著28篇；主持军队重大专项子课题1项，国家自然科学基金1项，军队及省部级课题各3项；参加“863”重点课题，“十二五”、“十三五”国家重大科技专项等课题13项。获国家专利11项；主编专著1部，副主编专著3部，参编专著8部。获得省级科技进步一等奖1项，并先后获得美国ASAIO青年医师奖，欧洲Euro-ELSO青年研究者奖，中国医师协会心血管外科分会杏林奖，树兰卓越工程青年医师资助计划，中华医学会胸心血管外科分会Lillehei 奖学金及厄尔巴肯奖学金。现任中国医师协会心血管外科分会结构性心脏病专委会委员，中国研究型医院学会血管外科专委会青年委员，陕西省药理学会心血管药理学专业委员会常委，陕西省生物医学工程学会体外循环专业委员会委员，中国医疗保健国际交流促进会心脏重症分会陕西省工作委员会委员。


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