西京结构文献谈｜3D生物打印主动脉瓣中细胞内蛋白质组学和细胞外囊泡组学作为疾病还原的度量标准
毛予 刘洋 杨剑 2025-02-14 19:14


2025年2月（总第14期）

作者：毛予 刘洋 杨剑


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引言：来自美国哈佛大学医学院的Elena Aikawa团队建立了一种基于生物材料的CAVD模型，模拟了人类易患纤维层的生物力学特性，并将其3D生物打印到96孔板中。通过液相色谱串联质谱分析细胞蛋白质组和囊泡组，比较了3D生物打印模型与传统的2D单细胞培养模型与人类CAVD组织之间的差异。3D生物打印模型高度重现了CAVD细胞蛋白质组（与2D蛋白质的70%相比，达到94%）。将细胞和囊泡数据集整合起来，识别出与AV钙化普遍相关的已知和未知蛋白质。哈佛大学医学院的研究团队研究探讨了2D和3D生物工程系统如何重现人类疾病的独特方面，将多组学作为一种评估高通量生物工程模型系统的技术，并为未来的药物发现提供了潜力。相关工作以题为“Intracellular proteomics and extracellular vesiculomics as a metric of disease recapitulation in 3D-bioprinted aortic valve arrays”的文章发表在2024年2月28日《Science Advances》。


摘要
钙化主动脉瓣病（CAVD）是一种活跃、细胞驱动、进行性疾病，其特征是瓣膜纤维化增厚，随后发生叶瓣钙化、瓣膜狭窄，最终导致心力衰竭和死亡。部分原因是由于缺乏适当的实验模型来帮助我们建立药物干预发展的分子基础，目前没有有效的药物可供使用。主动脉瓣（AV）叶片由其细胞外基质（ECM）组成的三个不同层次定义：富含胶原的纤维层、富含蛋白多糖的海绵层和富含弹性蛋白的心室层。瓣膜间质细胞（VICs）是AV中最常见的细胞类型。在生理条件下，VICs是静止的类成纤维细胞样细胞，并通过增殖和组织重塑维持瓣膜的稳态。然而，在病理条件下，这些VICs变得活化，并转化为肌成纤维细胞样细胞或促钙化的成骨细胞样细胞，在ECM中积极沉积羟基磷灰石。嵌入在更硬的纤维层中的VICs推动钙化扩散到海绵层，而相对不受影响的是心室层。因此，能够在易患疾病的纤维层等环境中研究VICs的能力对于增加对CAVD病理学的理解至关重要。在CAVD中，感受力敏感的瓣膜细胞对纤维化和钙化引起的组织硬化做出反应，进一步推动病理生理过程。由于缺乏（i）能够重现这种复杂环境的适当实验模型以及（ii）对新型工程主动脉瓣（AV）模型性能进行基准测试，目前没有药物治疗CAVD的药物。
创新研究内容
该研究利用细胞和EV蛋白质组学，通过评估作为静态生物力学特性的函数发生的细胞和EV蛋白质组水平的变化，全面而整体地表征体外模型对该疾病的重现。此外，该研究还开发、验证并对CAVD发病机制的3D生物工程模型系统进行基准测试，这些模型系统与高通量药物筛选平台兼容。

图1. 主动脉瓣模型的3D生物打印。（A）杂化GelMA/HAMA水凝胶合成示意图。黑色代表明胶，红色代表透明质酸（HA），绿色代表光交联形成的交联点，UV表示光引发剂。（B）打印过程示意图。具体打印参数可在材料与方法部分详细查阅。（C′）光交联后去除 pluronic 环的无细胞3D打印GelMA/HAMA水凝胶。（C″）接种VIC细胞的CAVD生物打印模型。细胞接种浓度为10⁷ cells/ml。（C‴）模型直接生物打印到96孔板中，以便立即进行原位培养。比例尺，1毫米。（D）海绵层样和纤维层样水凝胶存储模量的热图。（E）纳米压痕实验量化杨氏模量、存储模量和损耗模量[从左到右；每组条件下n=3个水凝胶，每组水凝胶上进行16-21次压痕实验]。（F）纤维层样水凝胶中VIC细胞在打印后第3天的活力染色最大强度投影图，左侧为直接添加培养基，右侧为延迟2小时添加培养基。绿色为Calcein AM活细胞标记，红色为Propidium Iodide死细胞标记。比例尺，100微米。（G）细胞活力定量：在打印后第3天和第14天，直接在打印过程中添加培养基确保了VIC细胞的长期活力（每组条件n=3个水凝胶）。（H）在打印后第1天直接添加培养基的情况下，第一和第九个纤维层样水凝胶中VIC细胞的活力在96孔板大小的阵列中无显著差异（每组n=6个水凝胶）。均值±标准差；**P<0.01；***P<0.001。

图2. 在有机和无机磷酸盐培养条件下，纤维层样水凝胶中培养的VICs维持活力并诱导钙化。（A）在正常培养基（NM）、富含有机磷酸盐的培养基（OM）和富含无机磷酸盐的致钙化培养基（PM）条件下，3D生物打印的VICs在14天培养后表现出高存活率。活力测定结果见（B）。在相同时间点，未观察到显著的凋亡染色（B）。（C）用Osteosense染色的VIC封装纤维层样水凝胶在NM、OM或PM中培养14天的代表性图像显示，在PM条件下染色阳性显著增加。白色：Osteosense 680EX双膦酸盐染料。（D）与NM和OM相比，PM条件下Osteosense阳性结节的数量显著增加。（E）与NM培养条件相比，PM条件下钙化结节的染色强度显著增加。均值±标准差，*P<0.05，**P<0.01。比例尺，100微米，每组n=3名供体，每名供体n=3个水凝胶。

图3. CAVD水凝胶模型的细胞蛋白质组揭示模拟病理学的翻译靶点。（A）蛋白质组学工作流程，包括研究的模型（2D，二维VIC单培养；3D，3D生物打印的VIC封装纤维层样水凝胶；AV，新鲜组织细胞和EV分离）、培养基条件（OM，成骨培养基；PM，致钙化培养基）以及多组学分析流程。（B）维恩图显示体外VIC数据集与无细胞GelMA/HAMA水凝胶蛋白质组学数据的重叠情况。GelMA/HAMA水凝胶与猪、牛和人数据库比对，以发现潜在的污染物序列。显示前三大基因本体论生物过程（GO BPs）及其对应蛋白质。（C）维恩图显示CAVD模型细胞蛋白质组学数据集的重叠情况，突出每个数据集中唯一识别的蛋白质。（D）三个细胞蛋白质组学数据集的主成分分析（PCA）图。（E）体外数据集的PCA图，按培养基处理条件着色。（F）火山图代表每组数据中差异丰度的蛋白质（#），不考虑培养基处理条件。（G）气泡图显示每个数据集中富集的GO BPs。AV的GO BP术语描述了与两个模型一致的离体VIC蛋白质组中富集的术语。（H）体外模型中差异富集（DE）蛋白质数量的柱状图，按培养基类型分类。（I）致钙化（PM）与正常（NM）条件下显著差异丰度蛋白质的log2（倍数变化）散点图，横轴为2D模型中富集的蛋白质，纵轴为3D模型中富集的蛋白质。沿外侧象限相似的蛋白质在每个数据集中被识别。（J）成骨（OM）与正常（NM）条件下显著差异丰度蛋白质的log2（倍数变化）散点图。假发现率（FDR）0.05；S0 0.1。注：3D和2D条件：n = 3名供体，每名供体3种培养基条件（NM、OM和PM），总共n = 9个样本每组；AV条件：n = 4名供体，无培养基处理或培养。

图4. 3D生物打印模型的细胞蛋白质组最能模拟钙化条件下的CAVD细胞病理学特征。（A）多散点图显示所有培养基和模型条件下蛋白质的log2（倍数变化）丰度。右上半部分展示密度图，而左下半部分展示对应散点图的相关系数。
（B）柱状图显示每种培养基条件下差异富集蛋白质的数量，比较了AV和2D条件。
（C）柱状图显示每种培养基条件下差异富集蛋白质的数量，比较了AV和3D条件。[(B)和(C)]数据来自后验校正的Hawaii分析（图S2）。
（D与G）所有模型和培养基条件下阈值差异丰富的蛋白质的热图。热图聚类趋势图突出显示在2D OM与AV以及2D PM与AV条件下表达相似的孤立蛋白。顶部GO BP（基因本体论生物过程）突出显示与相应调整后的P值。
（E-I）GO BP-蛋白质网络，突出显示在2D PM与CAVD（减少的[E]；增加的[F]）以及3D PM与AV（减少的[H]；增加的[I]）之间驱动相似性的关键蛋白质。如文中所述，自发钙化仅在3D模型中发生，NM条件下的模型也显示出蛋白质丰度的趋势。方差分析（ANOVA）q ≤ 0.05，Tukey HSD；FDR 0.05；S0 0.1。

图5. 细胞外囊泡（EVs）蛋白质组学揭示基质依赖性介质加载和普遍与AV相关的介质（A）EV蛋白质组学在所有三种模型和培养基条件下鉴定出超过1300种蛋白质，其中包括26种EV标记物。（B）三种EV数据集的无偏主成分分析（PCA）聚类图，按模型着色。（C和D）二维（C）和三维（D）EV蛋白质组数据集的无偏PCA聚类图，按培养基条件着色。（E）量化体外模型中NM、OM和PM培养基条件下差异表达的EV蛋白质数量。（F到H）火山图显示（D）中数据在NM（F）、OM（G）和PM（H）条件下的定量结果。仅显示显著差异表达（DE）且绝对倍数变化>1的蛋白质及其图例标注。（I）EV蛋白质组体外数据集的Hawaii图，与CAVD组织来源的EV货物蛋白质组进行比较，并校正多重比较。关键失调的小EV（sEV，橙色）和大EV（lEV，绿色）标记物被突出显示。实线：FDR 0.01%，S0 0.1；虚线：FDR 0.05%，S0 0.1。（J）网络图展示从（I）中差异表达蛋白质中整理出的前五大基因本体论生物过程（GO BP）及其对应蛋白质。
1. 细胞外基质组织（GO:0030198）
2. 细胞外结构组织（GO:0043062）
3. 中性粒细胞介导的免疫（GO:0002446）
4. 中性粒细胞脱颗粒作用（GO:0043312）
5. 中性粒细胞激活参与免疫反应（GO:0002283）
（K）体外来源EV货物蛋白质与CAVD组织来源EV货物蛋白质的前五大GO BP及其对应的调整后P值。
图6. 通过整合细胞和EV介质来源的蛋白质组的疾病模拟网络分析（A）规范相关性散点图展示了整合后的细胞和EV蛋白质组数据。通过排除NM条件，专注于驱动钙化的相关性。规范变量1最佳地描述了3D与2D模型之间的关系，而规范变量2最佳地描述了3D与AV模型之间的关系。（B）相关性圆图展示了这些规范变量对应的蛋白质分布，阈值设为0.8，突出显示高度相关的蛋白质。（C）聚类图像图（CIM）显示了EV和细胞来源蛋白质之间的相关性矩阵，其中红色表示高度正相关，蓝色表示高度负相关。（D）通过rCCA分析获得的相关性网络图，展示了显著蛋白质之间的关系。红色和绿色边分别表示高度正相关和高度负相关，节点大小反映了节点间性中心性，表示其在相关性网络中的重要性。总的来说，这些分析揭示了细胞和EV蛋白质组在钙化过程中相互作用和关联的复杂网络，为理解CAVD的病理机制提供了新的视角。

图7. 多组学整合分析揭示钙化过程中差异丰富的已知和未知蛋白质本图展示了整合的细胞和EV介质来源蛋白质组网络，突出了在3D PM、3D OM、2D PM和2D OM条件下与正常（NM）条件相比差异丰富的蛋白质。通过分别选择细胞和EVs的前20种蛋白质，并对其进行排序，构建了这一综合网络。此外，图S6中提供了支持该网络的进一步分析。

图8. 总结每种模型对CAVD组织细胞和EV模拟的前GO项对于每种模型，总结并分析了最能模拟疾病蛋白质特征的前细胞和EV蛋白质的GO生物过程（BP）。GO BP被分类为概括主要功能的关键术语。值得注意的是，3D水凝胶是唯一能够模拟ECM信号传导、N-和O-连接的糖基化，以及细胞-基质相互作用的模型。脂质调节在PM培养基条件下唯一被模拟，而细胞骨架调节在OM培养基条件下唯一被模拟。所有研究的模型均模拟了参与外泌体分泌和组装的蛋白质。

结论与下步展望

该研究注意到在NM条件下出现了轻度的自发性钙化，这可能是由于在生物打印过程中暴露于剪切应力和高达75 bar的压力，这两者都已被证明可以诱导肌成纤维细胞的活化。此外，本实验中使用的VICs来自患有疾病的人类瓣膜，可能包含了该研究团队之前证明的成骨肌成纤维细胞样细胞的一群细胞。尽管如此，与NM对照组相比，在3D培养中，在钙化培养基处理条件下，该研究在细胞和EV载体中发现了显著的蛋白质组学变化，证明了该模型的可行性。该研究利用基于自下而上的蛋白质组学鉴定的肽段的种属特异性，对细胞外基质（ECM）和其他潜在污染物进行了背景蛋白质组的整理。在未来的研究中，该研究将致力于使用针对ECM的蛋白质组学技术，来识别对胶原亚型、翻译后修饰和细胞-基质相互作用的机械响应。这些技术还可用于评估细胞和EV对水凝胶中使用的不同基质微环境的反应。这种EV分析还可以扩展到识别驱动EV与微囊泡分泌及其相应蛋白质组的因素。

文章来源

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj9793

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